Çevremizde sıradan gibi görünen, ancak aslında bize sessizce çok şey katan birçok isimsiz kahraman var. Proteinaz K, moleküler tanı endüstrisindeki "isimsiz kahraman"lardan biridir; ancak sektördeki "büyük ve güçlü" şirketlerle karşılaştırıldığında, proteinaz K o kadar mütevazıdır ki, önemini uzun süre göz ardı ettik. Yeni koronavirüs salgınının patlak vermesiyle birlikte proteinaz K'ya olan talep arttı ve yurt içi ve yurt dışındaki arz tüketimin çok gerisinde kaldı; bu durum herkes proteinaz K'nın ne kadar önemli olduğunu birden fark etmesine yol açtı.
Proteinaz K'nın kullanım amacı nedir?
Proteinaz K, proteolitik enzim aktivitesine sahip bir serin proteazdır ve geniş bir ortam aralığında (pH (4-12,5), yüksek tuzlu tampon, 70°C yüksek sıcaklık vb.) aktivitesini koruyabilir. Ayrıca, proteinaz K'nın aktivitesi SDS, üre, EDTA, guanidin hidroklorür, guanidin izotiyosiyanat vb. tarafından inhibe edilmez ve belirli miktarda deterjan da proteinaz K'nın aktivitesini artırabilir. Tıbbi tedavide (virüs ve mikrobiyal dezenfeksiyon), gıdada (et yumuşatma), deride (tüy yumuşatma), şarap yapımında (alkol berraklaştırma), amino asit hazırlamada (bozulmuş tüyler), nükleik asit ekstraksiyonunda, in situ hibridizasyonda vb. proteinaz K'nın uygulamaları vardır. En yaygın kullanılan uygulama nükleik asit ekstraksiyonudur.
Proteinaz K, örnekteki her türlü proteini, nükleik asitlere sıkıca bağlı olan histonlar da dahil olmak üzere, enzimatik olarak parçalayabilir; böylece nükleik asitler örnekten ayrılarak ekstrakta geçebilir ve bir sonraki ekstraksiyon ve saflaştırma aşamasını kolaylaştırabilir. Viral nükleik asit tespitinde, proteinaz K, virüs örnekleme çözeltisinin önemli bileşenlerinden biridir. Proteinaz K, virüsün kılıf proteinini parçalayarak etkisiz hale getirebilir, bu da taşıma ve tespit aşamasında daha güvenlidir; ayrıca proteinaz K, RNaz'ı parçalayarak viral RNA'nın parçalanmasını önler ve nükleik asit tespitini kolaylaştırır.
Proteinaz K'nın bir gecede kazandığı şöhret.
Gerek bilimsel araştırmalar alanında gerekse IVD alanında, nükleik asit ekstraksiyonu en temel deneylerden biridir; bu nedenle proteinaz K her zaman çok önemli bir varlık olmuştur. Ancak geçmişte proteinaz K'nın rolü, önemine kıyasla çok daha az biliniyordu. Bunun büyük bir nedeni, proteinaz K'nın arz ve talep ilişkisinin çok istikrarlı olmasıydı. Proteinaz K tedarikinin bir sorun olabileceğini çok az kişi düşünürdü.
Yeni koronavirüs salgınının patlak vermesiyle birlikte nükleik asit testlerine olan talep hızla arttı. Haziran 2020 sonu itibarıyla Çin, yaklaşık 90 milyon yeni koronavirüs testi tamamladı ve bu sayı küresel ölçekte daha da endişe verici. Nükleik asit ekstraksiyon deneylerinde, proteinaz K'nın çalışma konsantrasyonu yaklaşık 50-200 μg/mL'dir. Genellikle, bir nükleik asit örneğini ekstrakte etmek için yaklaşık 100 μg proteinaz K gerekir. Gerçek kullanımda, nükleik asit ekstraksiyon verimliliğini artırmak için genellikle daha fazla miktarda proteinaz K kullanılır. Yeni koronavirüsün nükleik asit tespiti, büyük miktarda proteinaz K talebine yol açtı. Proteinaz K'nın orijinal arz ve talep dengesi hızla bozuldu ve proteinaz K bir gecede önemli bir salgın önleme malzemesi haline geldi.
Proteinaz K üretiminde yaşanan zorluklar
Salgının gelişmesiyle birlikte proteinaz K'nın önemi insanlar tarafından daha çok anlaşılmış olsa da, proteinaz K'nın aşırı derecede düşük profilli olması nedeniyle, yerli şirketlerin proteinaz K üretimine az sayıda dahil olması utanç vericidir. İnsanlar proteinaz K üretimi kurmak istediklerinde, üretim sürecinde proteinaz K'nın son derece özel bir protein olduğu keşfedilmiştir. Kısa sürede proteinaz K üretim kapasitesini genişletmek son derece zordur.
Proteinaz K'nın büyük ölçekli üretimi aşağıdaki zorluklarla karşı karşıyadır.
1. Düşük ifade
Proteinaz K, çoğu proteini spesifik olmayan bir şekilde parçalayabilir ve ekspresyon konakçı hücreye ciddi toksisiteye neden olabilir. Bu nedenle, proteinaz K'nın ekspresyon seviyesi genellikle çok düşüktür. Proteinaz K'yı yüksek düzeyde eksprese eden ekspresyon sistemlerinin ve suşlarının taranması genellikle daha uzun bir döngü gerektirir.
2. Pigment ve nükleik asit kalıntıları
Büyük ölçekli fermantasyon, büyük miktarda pigment ve konakçı nükleik asit kalıntısı ortaya çıkarır. Bu safsızlıkları basit bir arıtma işlemiyle gidermek zordur ve karmaşık arıtma maliyeti artırır ve geri kazanım oranını düşürür.
3. İstikrarsızlık
Proteinaz K yeterince kararlı değildir, kendi kendini enzimatik olarak parçalayabilir ve koruyucu bir madde olmadan 37°C'de uzun süre stabil bir şekilde saklanması zordur.
4. Kolay çökelir
Proteinaz K'nın dondurularak kurutulmuş tozunu hazırlarken, dondurularak kurutulmuş tozda proteinaz K'nın katı madde içeriğinin yüksek olmasını sağlamak için yüksek konsantrasyonda dondurularak kurutma koruyucu madde eklenmesi gerekir; ancak proteinaz K konsantrasyonu 20 mg/mL ve üzerine çıktığında, kolayca kümelenme meydana gelir ve bu da yüksek katı madde içeriğine sahip proteinaz K'nın dondurularak kurutulmasını büyük zorluklara yol açar.
5. Büyük yatırım
Proteinaz K, güçlü proteaz aktivitesine sahiptir ve laboratuvarda diğer proteazları hidrolize edebilir. Bu nedenle, proteinaz K'nın araştırma, geliştirme ve üretimi için özel üretim alanları, ekipman ve personele ihtiyaç duyulmaktadır.
XD BIOCHEM'in proteinaz K çözümü
XD BIOCHEM, olgun bir protein ekspresyon ve saflaştırma platformuna sahip olup, rekombinant proteinlerin ekspresyonu ve saflaştırılması ile üretim süreçlerinin optimizasyonunda zengin deneyime sahiptir. Hızlı bir şekilde oluşturulan araştırma ve geliştirme ekibi sayesinde, proteinaz K'nın büyük ölçekli üretim süreci aşılmıştır. Aylık dondurularak kurutulmuş toz üretimi 30 kg'ın üzerindedir. Ürün, istikrarlı performansa, yüksek enzim spesifik aktivitesine ve konakçı sitokrom ve nükleik asit kalıntısı içermemesine sahiptir. XD BIOCHEM ile iletişime geçin ve deneme paketi alın (E-posta:sales@xdbiochem.comTel: +86 513 81163739).
XD BIOCHEM'in teknik çözümleri şunları içerir:
Çoklu kopya plazmit entegrasyonu kullanılarak, 8 g/L ekspresyon seviyesine sahip yüksek ekspresyonlu suşlar seçilir ve böylece proteinaz K'nın düşük ekspresyon seviyesi sorunu aşılır.
Çok aşamalı bir saflaştırma sürecinin oluşturulmasıyla, proteinaz K'nın konakçı sitokrom ve nükleik asit kalıntıları standart değerin altına başarıyla indirildi.
Yüksek verimli tarama yöntemiyle koruyucu tampon formülasyonları incelenerek, proteinaz K'yı 37°C'de stabil bir şekilde depolayabilen bir tampon seçildi.
Tarama tamponları, proteinaz K'nın yüksek konsantrasyonlarda kolayca kümelenip çökelmesi sorununu ortadan kaldırır ve proteinaz K'nın yüksek katı madde içeriğine sahip dondurarak kurutulması için temel oluşturur.
XD BIOCHEM proteinaz K örneği
XD BIOCHEM proteinaz K stabilite testi: Oda sıcaklığında 80 gün sonra aktivitede önemli bir değişiklik olmayacaktır.
XD BIOCHEM proteinaz K stabilite testi: Oda sıcaklığında 80 gün sonra aktivitede önemli bir değişiklik olmayacaktır.
XD BIOCHEM proteinaz K ve rakip ürünlerin nükleik asit ekstraksiyon etkisinin karşılaştırılması. Nükleik asit ekstraksiyon sürecinde sırasıyla XD BIOCHEM ve rakip proteinaz K kullanılmıştır. XD BIOCHEM proteinaz K'nın ekstraksiyon verimliliği daha yüksek ve hedef genin Ct değeri daha düşüktür.
Yayın tarihi: 31 Aralık 2021