IPTG (izopropil-β-D-tiyogalaktozit), yüksek oranda indüklenebilir bir β-galaktosidaz substratının analoğudur. IPTG'nin indüksiyonu altında, indükleyici protein baskılayıcı proteinle kompleks oluşturabilir, böylece baskılayıcı proteinin konformasyonu değişir ve hedef genle birleşemez, böylece hedef gen verimli bir şekilde ifade edilir. Peki deney sırasında IPTG konsantrasyonu nasıl belirlenmelidir? Ne kadar yüksek olursa o kadar mı iyi?
Öncelikle, IPTG indüksiyonunun prensibini anlayalım: E. coli'nin laktoz operonu (elementi), sırasıyla β-galaktosidaz, permeaz ve asetiltransferazı kodlayan Z, Y ve A olmak üzere üç yapısal gen içerir. lacZ, laktozu glikoz ve galaktoza veya allo-laktoza hidrolize eder; lacY, ortamdaki laktozun hücre zarından geçmesine ve hücreye girmesine izin verir; lacA, asetil grubunu asetil-CoA'dan β-galaktoside aktarır ve bu da toksik etkiyi ortadan kaldırmayı içerir. Ek olarak, bir işletme dizisi O, bir başlangıç dizisi P ve bir düzenleyici gen I vardır. I geni, işletme dizisinin O pozisyonuna bağlanabilen bir baskılayıcı proteini kodlar, böylece operon (meta) baskılanır ve kapatılır. Ayrıca, başlatıcı dizi P'nin yukarısında katabolik gen aktivatör proteini-CAP bağlanma bölgesi de bulunmaktadır. P dizisi, O dizisi ve CAP bağlanma bölgesi birlikte lac operonunun düzenleyici bölgesini oluşturur. Üç enzimin kodlayıcı genleri, gen ürünlerinin koordineli ifadesini sağlamak için aynı düzenleyici bölge tarafından düzenlenir.
Laktoz yokluğunda, lak operonu (meta) baskılanmış durumdadır. Bu sırada, PI promotör dizisinin kontrolü altında I dizisi tarafından ifade edilen lak baskılayıcı protein, O dizisine bağlanarak RNA polimerazın P dizisine bağlanmasını engeller ve transkripsiyon başlatılmasını inhibe eder; laktoz mevcut olduğunda, lak operonu (meta) indüklenebilir. Bu operon (meta) sisteminde, gerçek indükleyici laktozun kendisi değildir. Laktoz hücreye girer ve β-galaktosidaz tarafından katalize edilerek allolaktoza dönüştürülür. İkincisi, bir indükleyici molekül olarak, baskılayıcı proteine bağlanır ve protein konformasyonunu değiştirir; bu da baskılayıcı proteinin O dizisinden ayrılmasına ve transkripsiyona yol açar. İzopropiltiyogalaktozit (IPTG) de allolaktoz ile aynı etkiye sahiptir. Çok güçlü bir indükleyicidir, bakteriler tarafından metabolize edilmez ve çok kararlıdır, bu nedenle laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılır.
IPTG'nin optimum konsantrasyonu nasıl belirlenir? E. coli'yi örnek alalım.
Pozitif rekombinant pGEX (CGRP/msCT) içeren genetik olarak tasarlanmış E. coli BL21 suşu, 50 μg·mL-1 Amp içeren LB sıvı ortamına aşılandı ve 37 °C'de bir gece boyunca kültüre edildi. Yukarıdaki kültür, çoğaltma kültürü için 1:100 oranında 50 μg·mL-1 Amp içeren 50 mL'lik 10 şişe taze LB sıvı ortamına aşılandı ve OD600 değeri 0,6~0,8 olduğunda, son konsantrasyona ulaşacak şekilde IPTG eklendi. Bu konsantrasyonlar sırasıyla 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1'dir. Aynı sıcaklık ve aynı sürede indüksiyon işleminden sonra, bakteri çözeltisinden 1 mL alındı ve bakteri hücreleri santrifüj yoluyla toplandı ve farklı IPTG konsantrasyonlarının protein ekspresyonu üzerindeki etkisini analiz etmek için SDS-PAGE'ye tabi tutuldu, ardından en yüksek protein ekspresyonuna sahip IPTG konsantrasyonu seçildi.
Deneylerden sonra, IPTG konsantrasyonunun mümkün olduğunca yüksek olmaması gerektiği görülecektir. Bunun nedeni, IPTG'nin bakteriler için belirli bir toksisiteye sahip olmasıdır. Konsantrasyonun aşılması da hücreyi öldürecektir; ve genel olarak, hücrede ifade edilen çözünür protein miktarı ne kadar fazla olursa o kadar iyi olur, ancak birçok durumda IPTG konsantrasyonu çok yüksek olduğunda, büyük miktarda inklüzyon oluşacak, ancak çözünür protein miktarı azalacaktır. Bu nedenle, en uygun IPTG konsantrasyonu genellikle "ne kadar yüksekse o kadar iyi" değil, "ne kadar düşükse o kadar iyi"dir.
Genetiği değiştirilmiş suşların indüksiyonu ve kültivasyonunun amacı, hedef proteinin verimini artırmak ve maliyetleri düşürmektir. Hedef genin ekspresyonu sadece suşun kendi faktörleri ve ekspresyon plazmidiyle değil, aynı zamanda indükleyici konsantrasyonu, indüksiyon sıcaklığı ve indüksiyon süresi gibi diğer dış koşullarla da etkilenir. Bu nedenle, genel olarak, bilinmeyen bir proteinin ekspresyonu ve saflaştırılmasından önce, uygun koşulları seçmek ve en iyi deneysel sonuçları elde etmek için indüksiyon süresi, sıcaklık ve IPTG konsantrasyonunun incelenmesi en iyisidir.
Yayın tarihi: 31 Aralık 2021