IPTG (izopropil-β-D-tiyogalaktosid), yüksek oranda uyarılabilir olan bir β-galaktosidaz substratının analoğudur.IPTG'nin indüksiyonu altında, indükleyici, baskılayıcı protein ile bir kompleks oluşturabilir, böylece baskılayıcı proteinin yapısı değişir, böylece hedef gen ile birleştirilemez ve hedef gen verimli bir şekilde ifade edilir.Peki deney sırasında IPTG konsantrasyonu nasıl belirlenmelidir?Ne kadar büyükse o kadar iyi mi?
Öncelikle IPTG indüksiyonunun prensibini anlayalım: E. coli'nin laktoz operonu (elementi), sırasıyla β-galaktosidaz, permeaz ve asetiltransferazı kodlayan Z, Y ve A olmak üzere üç yapısal gen içerir.lacZ, laktozu glikoz ve galaktoza veya allo-laktoza hidrolize eder;lacY ortamdaki laktozun hücre zarından geçip hücreye girmesini sağlar;lacA, asetil grubunu asetil-CoA'dan β-galaktoside aktarır; bu, Toksik etkinin ortadan kaldırılmasını içerir.Ek olarak, bir çalışma dizisi O, bir başlangıç dizisi P ve bir düzenleyici gen I vardır. I gen kodu, operatör dizisinin O pozisyonuna bağlanabilen bir baskılayıcı proteindir, böylece operon (meta) bastırılır ve kapalı.Ayrıca, başlatıcı sekans P'nin üst akışında katabolik gen aktivatör protein-CAP bağlanma sahası için bir bağlanma bölgesi mevcuttur. P sekansı, O sekansı ve CAP bağlanma sahası birlikte lac operonunun düzenleyici bölgesini oluşturur.Üç enzimin kodlayıcı genleri, gen ürünlerinin koordineli ifadesini sağlamak için aynı düzenleyici bölge tarafından düzenlenir.
Laktozun yokluğunda lak operonu (meta) baskı altındadır.Bu sırada, PI promoter sekansının kontrolü altında I sekansı tarafından eksprese edilen lac baskılayıcı, O sekansına bağlanır; bu, RNA polimerazın P sekansına bağlanmasını önler ve transkripsiyonun başlatılmasını engeller;laktoz mevcut olduğunda lak operonu (meta) indüklenebilir. Bu operon (meta) sisteminde gerçek indükleyici laktozun kendisi değildir.Laktoz hücreye girer ve β-galaktosidaz tarafından katalize edilerek allolaktoza dönüştürülür.İkincisi, bir indükleyici molekül olarak baskılayıcı proteine bağlanır ve protein konformasyonunu değiştirir, bu da baskılayıcı proteinin O dizisinden ve transkripsiyondan ayrılmasına yol açar.İzopropiltiyogalaktoz (IPTG), allolaktoz ile aynı etkiye sahiptir.Bakteriler tarafından metabolize edilmeyen ve oldukça stabil olan çok güçlü bir indükleyicidir, bu nedenle laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
IPTG'nin optimal konsantrasyonu nasıl belirlenir?Örnek olarak E. coli'yi ele alalım.
Pozitif rekombinant pGEX (CGRP/msCT) içeren genetik olarak tasarlanmış E. coli BL21 suşu, 50μg·mL-1 Amp içeren LB sıvı ortamına aşılandı ve gece boyunca 37°C'de kültürlendi.Yukarıdaki kültür, genişletme kültürü için 1:100 oranında 50μg·mL-1 Amp içeren 10 şişe 50mL taze LB sıvı ortamına aşılandı ve OD600 değeri 0,6~0,8 olduğunda, son konsantrasyona IPTG eklendi.0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1'dir.Aynı sıcaklıkta ve aynı sürede indüksiyondan sonra, buradan 1 mL bakteri solüsyonu alındı ve bakteri hücreleri santrifüjleme yoluyla toplandı ve farklı IPTG konsantrasyonlarının protein ekspresyonu üzerindeki etkisini analiz etmek için SDS-PAGE'ye tabi tutuldu ve ardından en büyük protein ifadesine sahip IPTG konsantrasyonunu seçin.
Deneylerden sonra IPTG konsantrasyonunun mümkün olduğu kadar büyük olmadığı görülecektir.Bunun nedeni IPTG'nin bakterilere karşı belirli bir toksisiteye sahip olmasıdır.Konsantrasyonun aşılması da hücreyi öldürecektir;ve genel olarak konuşursak, hücrede ne kadar çok çözünür protein ifade edilirse o kadar iyi olacağını umuyoruz, ancak çoğu durumda IPTG konsantrasyonu çok yüksek olduğunda büyük miktarda katılım oluşacaktır.Vücutta ancak çözünebilir protein miktarı azaldı.Bu nedenle, en uygun IPTG konsantrasyonu genellikle ne kadar büyükse o kadar iyidir, ancak konsantrasyon ne kadar düşükse o kadar iyidir.
Genetiği değiştirilmiş suşların indüksiyonu ve kültivasyonunun amacı, hedef proteinin verimini arttırmak ve maliyetleri azaltmaktır.Hedef genin ekspresyonu yalnızca suşun kendi faktörlerinden ve ekspresyon plazmidinden etkilenmez, aynı zamanda indükleyicinin konsantrasyonu, indüksiyon sıcaklığı ve indüksiyon süresi gibi diğer dış koşullardan da etkilenir.Bu nedenle genel olarak bilinmeyen bir protein ifade edilip saflaştırılmadan önce, uygun koşulları seçmek ve en iyi deneysel sonuçları elde etmek için indüksiyon süresini, sıcaklığı ve IPTG konsantrasyonunu incelemek en iyisidir.
Gönderim zamanı: 31 Aralık 2021