Dithiothreitol (DTT), yeni yeşil katkı maddesi olarak da bilinen, yaygın olarak kullanılan bir indirgeyici maddedir.İki merkaptan grubuna (-SH) sahip küçük moleküler bir organik bileşiktir.İndirgeyici özellikleri ve kararlılığı nedeniyle DTT, biyokimya ve moleküler biyoloji deneylerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
DTT'nin ana rolü proteinler ve diğer biyomoleküllerdeki disülfit bağlarını azaltmaktır.Disülfür bağı, protein katlanmasının ve stabilitesinin önemli bir parçasıdır, ancak indirgenebilir SDS-PAGE analizi, protein rekombinasyonu ve katlanması gibi belirli deneysel koşullar altında, disülfür bağının iki tiyol grubuna indirgenmesi, proteinin uzaysal yapısını çözmek için gereklidir. protein.DTT, disülfür bağlarıyla reaksiyona girerek bunları merkaptan gruplarına indirgeyebilir, böylece proteinin uzaysal yapısını açarak analiz edilmesini ve işlenmesini kolaylaştırır.
DTT ayrıca enzim aktivitesini ve stabilitesini korumak için de kullanılabilir.Bazı enzim katalizli reaksiyonlarda enzimin aktivitesi oksidan tarafından azaltılabilir.DTT, oksidanlarla reaksiyona girerek onları zararsız maddelere indirgeyebilir, böylece enzimin aktivitesini ve stabilitesini koruyabilir.
β-merkaptoetanol (β-ME) gibi geleneksel indirgeyici ajanlarla karşılaştırıldığında DTT'nin daha güvenli ve daha stabil bir indirgeyici ajan olduğu düşünülmektedir.Sulu çözeltide stabil olmasının yanı sıra yüksek sıcaklık ve asit-baz koşullarında indirgeyici özelliklerini de korur.
DTT'nin kullanımı nispeten basittir.Genel olarak DTT uygun bir tamponda eritilir ve daha sonra deney sistemine eklenir.Optimum DTT konsantrasyonunun spesifik deneye göre belirlenmesi gerekir ve genellikle 0,1-1 mM aralığında kullanılır.Daha düşük konsantrasyonlar hücre büyümesi üzerindeki olumsuz etkileri azaltabilir ve hedef proteinlerin aşırı ekspresyonundan kaynaklanan sitotoksisiteyi azaltabilir.Daha yüksek konsantrasyonlar aşırı hücre metabolik yüküne neden olarak hücre büyümesini ve ekspresyon verimliliğini etkileyebilir.
Optimum konsantrasyonu belirlemenin yolu, farklı konsantrasyonlarda IPTG indüksiyon testleri yaparak hedef proteinin ekspresyon düzeyini değerlendirmek olabilir.Küçük ölçekli kültür testleri, bir dizi IPTG konsantrasyonu (örn. 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, vb.) kullanılarak gerçekleştirilebilir ve farklı konsantrasyonlardaki ekspresyon etkisi, hedef proteinin ekspresyon seviyesinin (örn. Western) tespit edilmesiyle değerlendirilebilir. leke veya floresans tespiti).Deneysel sonuçlara göre en iyi ekspresyon etkisine sahip konsantrasyon, optimal konsantrasyon olarak seçildi.
Ek olarak, benzer deneysel koşullar altında yaygın olarak kullanılan IPTG konsantrasyon aralığını anlamak ve ardından deneysel ihtiyaçlara göre optimize etmek ve ayarlamak için ilgili literatüre veya diğer laboratuvarların deneyimlerine de başvurabilirsiniz.
Optimum konsantrasyonun farklı ekspresyon sistemlerine, hedef proteinlere ve deneysel koşullara bağlı olarak değişebileceğini unutmamak önemlidir; bu nedenle duruma göre optimize etmek en iyisidir.
Özetle DTT, proteinler ve diğer biyomoleküllerdeki disülfit bağlarını azaltmak, enzim aktivitesini ve stabilitesini korumak için kullanılabilen, yaygın olarak kullanılan bir indirgeyici ajandır.Biyokimya ve moleküler biyoloji deneylerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Gönderim zamanı: Eylül-28-2023